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临床热点 | 病原微生物宏基因组检测
浏览量:142   发布时间:2019/12/13 15:53:05

宏基因组学(metagenomics)的概念在1998年被首次提出,它是指运用基因组学技术,对环境或生物样本中的核酸分子进行无差别、无选择性的测序,测序结果与已知的微生物序列数据库比对分析,从而对样本中所包含的微生物进行定性或定量分析的一种技术。mNGS对病原体的覆盖极其全面,不需要微生物培养,不需要根据经验进行预设,可以检测耐药突变和毒力基因,为急危重症和未明原因感染的临床诊治提供了全新的思路和解决方案。


01

疑难危重感染病原学诊断亟待突破


感染性疾病多为细菌、病毒和真菌等病原体及其产物所引起的局部或全身性炎症或器官功能障碍,具有较大的危害性和较高的病死率。目前,全球感染性疾病的发病率有所上升,病原体呈现多样化和复杂化的发展趋势。


重症急性呼吸综合征、新型冠状病毒感染、新变异型克雅病、H7N9 禽流感等新发感染性疾病不断出现。而HIV、多重或广谱耐药的结核分枝杆菌、沙眼支原体等经典感染性疾病病原体又死灰复燃或出现新的致病特征。各种新发和再发的感染性疾病、不易发现的多重感染以及不明病因的发热等,都给人类健康带来了巨大的威胁;如脓毒症 ( 严重感染) 患者病死率高达50%。





下呼吸道感染发病率在全球感染性疾病位居榜首,预估中国每年新发下呼吸道感染患者约1000万/年。




因此,临床上对感染性疾病诊断的准确性和时效性提出了更高的要求。


02

新一代感染辅助诊断方法—mNGS



传统的检测方法在敏感性,特异性,时效性,信息量等方面存在局限,而且对于未知或者罕见的病原微生物,无法快速识别。


基于宏基因组新一代测序技术(metagenomics next generation sequencing, mNGS) 不依赖于传统的微生物培养,直接对临床样本中的核酸进行高通量测序,然后与数据库进行比对分析,根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类,能够快速,客观地检测临床样本中的较多病原微生物(包括病毒,细菌,真菌,寄生虫),且无需特异性扩增。




正是凭借上述优点,mNGS被越来越多的临床医生认可和使用,相关的技术标准和临床指南也层出不穷:2016年,美国药监局(FDA)发布mNGS体外诊断产品指南草案;2018年,mNGS被写入中国成人院内感染肺炎(HAP)和呼吸机相关肺炎(VAP)诊断和治疗指南。同年,mNGS被提议用于儿童呼吸道细菌和病毒感染诊断;2019年,mNGS在急危重症感染应用的首个专家共识发布。


mNGS最新指南/专家共识



(1)FDA发布感染病NGS临床应用指导性文件

2016年5月13日,美国FDA发布感染NGS临床应用指导性草案,指出NGS可用于临床样本病原菌的检测辅助临床精准治疗,实现病原鉴定、耐药基因和毒力因子分析。

(2)《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南(2018年版)》

中华结核和呼吸杂志2018,41(4):255-280

该指南指出:基于测序技术的临床宏基因组学,通过分析临床标本中微生物的DNA或RNA含量与丰度判断致病菌,显著提高了病原检测的灵敏度,缩短了检测时间,对罕见病原菌感染的诊断具有优势,可审慎地用于现有成熟检测技术不能确定的病原体,或经恰当与规范抗感染治疗无效的患者。

(3)《儿童呼吸道感染微生物检验标本采集转运与检测建议(细菌篇/病毒篇)》

中国实用儿科杂志2018,33(9):657-669

二代测序技术不但在高通量方面表现出优势,而且在发现新病原方面也有突破性进展。

(4)《宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识(2019)》

中华急诊医学杂志2019,28(2):151-155

2019年2月《中华急诊医学杂志》发表了首篇mNGS临床应用的专家共识,肯定了mNGS分析和诊断技术是急危重症感染快速、精准诊疗的发展方向,并对宏基因组临床应用场景,研究进展,基本流程,挑战和未来发展方向做出详细概述。





(1)主要应用科室:ICU、呼吸科、感染科、儿科和神经内科;
(2)应用科室:骨科、血液科、肿瘤科、检验科等。



03

mNGS临床应用需解决的问题


任何一项技术都存在利弊,mNGS也不例外。在开展病原微生物宏基因组检测之前,从业者需要认真思考以下几个问题并提出切实可行的解决方案:


01

时效性

mNGS需要对不同类型的临床样本进行预处理,操作步骤包括但不限于:核酸提取、文库制备、纯化、定量、上机前质控、pooling等。再加上测序反应和数据分析,整体流程复杂、耗时长,自动化程度低。核酸在扩增后有可能产生气溶胶污染,而大多数文库制备方法包含PCR扩增步骤,因此实验室在防止污染和质量控制上需要建立一系列标准化SOP。由于技术本身的复杂性,目前mNGS多以送检服务为主,样本周转时间(TAT)一般为72小时。而对危重感染患者而言,时间就是生命。如何进一步缩短TAT,尽快汇报检测结果,是亟需解决的问题之一。


02

准确性

mNGS可以覆盖10000种以上病原体,检测灵敏度很高。这是把双刃剑,在实际临床取样、运输、样本处理、上机测序等环节中都有可能受到环境、容器、试剂中的微生物核酸污染。另一方面,人体含有定植性的微生物(不同个体、不同样本类型,定植微生物的种类和丰度有较大差异)。这些因素都会导致mNGS结果中含有大量非致病性微生物,而真实的病原体则隐藏在定植和背景微生物中。因此,如何结合样本类型、实验对照和临床信息来准确判断病原体,是必须攻克的难题。


03

检测DNA or DNA+RNA?

众所周知,一些病毒的基因组为RNA,用DNA建库的方法不能检出。此外,RNA与DNA的测序结果可以互为确认和补充。同时,RNA丰度与基因转录活跃程度正相关,检测RNA可以识别死菌和活菌,区分现行和既往感染。因此,DNA+RNA测序与DNA测序相比具有多重优势,尤其在儿童感染中有很大需求,但人源RNA比DNA有更高的丰度和复杂度,且RNA易降解,对样本运输和保存有更高的要求。如何稳定有效地实现DNA和RNA同时检测,是提升mNGS临床检出率和准确性的保障之一。


展望:更快、更准、更智能


高通量测序和庞大的微生物基因组数据库赋予了mNGS无与伦比的病原体覆盖广度。从上文的分析中不难推断,这项技术必然朝着“更快、更准、更智能”的方向发展。


mNGS是一项潜力巨大的检测技术,随着测序平台、实验操作、数据分析流程的完善和临床研究的深入,mNGS必定会为急危重症和疑难感染患者提供精准的病原体诊断依据,辅助临床医师在第一时间了解病因,制定治疗方案,挽救患者的生命。


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